首頁

〔許瑞祥2015演講〕靈芝免疫調節蛋白的開發與應用

  • 列印

作為〈2015靈芝研發與應用學術研討會〉第一位演講者,許瑞祥教授把重心聚焦在小孢子靈芝免疫調節蛋白 GMI 的發現、研發、量產與應用。預計2016年即將有 GMI 的保健食品在美國正式上市,這將是第一個成功商品化且打入國際市場的靈芝單一活性成分,而「可以量產」則是此活性蛋白比靈芝多醣和三萜提早達陣的關鍵因素。

主講/許瑞祥   整理/吳亭瑤

 

作為〈2015靈芝研發與應用學術研討會〉第一位演講者,臺大許瑞祥教授把重心聚焦在小孢子靈芝免疫調節蛋白 GMI 的發現、研發、量產與應用,不僅緊扣此次靈芝研討會「研發」與「應用」兩大主題,更呼應大會主席林志彬教授強調靈芝進軍國際的必備條件──安全、有效,質量可控。

誠如許瑞祥所言,「我們研究靈芝這麼久,當然希望靈芝的成分可以改善人類和動物的健康」,2016年即將有訴求抗發炎、抗氧化、調節免疫、調節血糖……的 GMI 保健食品在美國正式上市,這也將是第一個成功商品化且打入國際市場的靈芝單一活性成分,而「可以量產」則是此活性蛋白比靈芝多醣和三萜提早達陣的關鍵因素。

GMI 的產業化將把靈芝的應用帶入另一個新時代,但演講一開始,研究靈芝栽培與菌種鑑定起家的許瑞祥還是從最基本的「何謂赤芝」談起,因為唯有追本溯源把根本弄清楚了、穩固了,展望的未來才會實在。

2015-rsh2

許瑞祥教授的靈芝研究歷程

1981~1989年:以形態分類、生化特性、交配育種研究靈芝,開發、提供生產和研究用的菌株。

1990~1999年:建構靈芝屬的分子生物學鑑定系統(以基因鑑定靈芝),提供確認物種的平台技術。

2000年迄今:以靈芝特殊基因的開發應用為主,將靈芝裡的功能性蛋白單獨開發應用。

 

赤芝不只一種,Ganoderma lucidum 同名異種問題嚴重

中華人民共和國藥典把多孔菌科的赤芝(Ganoderma lucidum)和紫芝(G. sinenese)列為藥材。但什麼靈芝是赤芝?赤芝的學名是否為 G. lucidum?這是作為靈芝發源地的中國,不論學術界或產業界,必須深刻思考的問題。

三十年前我剛開始做靈芝研究時,台灣靈芝農場種的都是紅色靈芝,他們都說他們種的是赤芝,也就是 G. lucidum,但我怎麼看都覺得那裡面的靈芝並非只有一個物種。

於是我花了六年的時間(1984~1990)建立「靈芝分類鑑定系統」當作我的博士論文1,經比對某一特定區段的基因序列(限制酶水解基因片段多型性圖譜),確定台灣農民常種的紅色靈芝其實包含兩個種:G. lucidum 和 G. tsugae(松杉靈芝),而這個物種是無法交配的,所以確定是兩個完全不同的物種(圖一)。

GMI-01

〔圖一〕1989 年許瑞祥以人工栽培獲得的靈芝(G. lucidum,圖左)與松杉靈芝(G. tsugae,圖右),

它們無法交配產生下一代,因此確定是兩個完全不同的物種。(提供/許瑞祥)

 

1995 年我們把世界各地收集到的紅色靈芝,以基因鑑定的方式(比對核糖體的基因序列)進行分類,結果發現可以分出很多群(圖二),這表示不同國家地區所指稱的G. lucidum實際並非同一物,而是包含好幾個不同的物種2

為了幫助大家快速確認自己用的是什麼菌種,我們找到了一個功能性基因──超氧歧化酶(SOD)的基因──它帶有一個非轉譯區的序列,可以把靈芝屬菌株分得很清楚(圖三)3

所以,我相信過去中文文獻上所寫的「赤芝」至少包含 G. lucidum(靈芝)、G. tsugae(松杉靈芝)、G. capense(薄樹芝)、G. boninense(狹長孢靈芝)、G. tenue(密紋薄芝)等栽培種類。在西方文獻中所指的「G. lucidum」就更複雜了,可能包括:G. ahmadiiG. boninenseG. lucidum、G. oregonense、G. pfeifferi G. resinaceum、G. tsugae、G. valesiacum……等種,這些物種在不同的國家地區都被用 G. lucidum 當學名。

GMI-02

〔圖二〕利用核糖體基因序列分析不同地區紅色靈芝的親緣關係。(提供/許瑞祥)

 

GMI-03

〔圖三〕利用 Mn-SOD 基因序列進行靈芝屬菌㮔類源關係鑑定之結果。(提供/許瑞祥)

 

Ganoderma lingzhi 是.......?

最近對於什麼是 G. lucidum 又有一些討論(圖四)。2012年戴玉成、吳聲華等提出,兩岸常用的 G. lucidum 應該是一個新的物種,叫作 G. lingzhi(4、5G. lingzhi 到底指的是什麼?仔細看他們發表的論文會發現,他改成 G. lingzhi 的第一支菌株,就是 1994 年我做基因鑑定的松杉靈芝。

在此要說明的是,我博士論文所指的靈芝和松杉靈芝,是根據當時中國科學院鄧叔群先生所鑑定的 G. lucidum 和徐連旺先生所鑑定的松杉靈芝,作為分類鑑定的依據(圖五)。所以吳聲華等於就是把我鑑定的松杉靈芝改名為 G. lingzhi 而已。

我個人覺得,如果分類一直改新學名,會讓學術界、產業界、產品開發和國際上造成極大的困擾,因為到底你用的是什麼材料,大家會搞不清楚。要用哪個學名來代表大家栽培常用的靈芝,可以再思考,沒有定論,但自己栽培的到底是哪個物種的哪個品系,絕對要弄清楚。

GMI-04

〔圖四〕資料來源/截取自《自由時報》網站 2012 年 7 月 6 日〈生活版〉新聞

 

GMI-05

〔圖五〕圖左為時中國科學院鄧叔群先生所鑑定的靈芝(G. lucidum),

圖右為徐連旺先生所鑑定的松杉靈芝(G. tsugae)。(提供/許瑞祥)

 

靈芝免疫調節蛋白的發現

靈芝的有效成分,包括多糖、三萜、腺苷等,從 1971 年開始陸續被發現。1989 年日本學者 Kino 在靈芝菌絲體裡找到一個活性蛋白叫 LZ-8。

當初發現 LZ-8 時就知道它可以促進淋巴細胞分裂、抑制某些過敏反應、改善第二型糖尿病等等。有趣的是 LZ-8 會凝集羊的紅血球,但不會凝集人的紅血球,代表它可能可以在人體內發揮一些作用。

這類蛋白因為具有調節免疫的作用,所以現在都被統稱為 fungal immunomodulatory protein(真菌免疫調節蛋白,簡稱 FIP)。這類蛋白並非只存在於靈芝(G. lucidum),金針菇、草菇、松杉靈芝、日本靈芝(G. japonicum)、小孢子靈芝(G. microsporum)、紫芝(G. sinense)等許多物種都有這類蛋白。最新文獻甚至指出6,連子囊菌綱的真菌都可找到類似的蛋白,表示在所有真菌家族演化的過程當中,都有這類蛋白存在。

正因為它是蛋白,可以透過基因轉譯大量生產,因此能比多醣和三萜更快被產業化應用。我接下來要報告的,就是這個蛋白被產業化應用的具體結果。

 

靈芝免疫調節蛋白的相關專利

一個成分能否被產業化應用,除了看它的科學文獻之外,還要看它的相關專利。我把這類蛋白的專利分成四個部分,第一部分是有關 LZ-8 的序列調整、更改,以及建構這類蛋白大量生產的表達系統,上海交通大學在這方面有一系列的專利。

第二個部分是吉林大學醫學院申請的專利,主要在做這類蛋白的分離、純化和功能(包括誘發癌細胞凋亡、減少缺血性損傷、治療血小板減少症),從專利內容和這些專利是與幾家產業公司合作申請的,可以看出他們正針對某個特定主題為 LZ-8 的產業開發做準備。

第三部分是由台灣的臺北醫學大學把 LZ-8 拿來做促進傷口癒合的專利。更早之前,還有台灣業者這個蛋白應用於免疫調節、改善第二型糖尿病、降低器官移植排斥效應等。

第四部分要和大家詳述的專利是 GMI(小孢子靈芝免疫調節蛋白),也是今天我報告的重點,它在抑制癌幹細胞和促進神經細胞生長方面的專利已在申請中。

 

GMI 的發現與量產

GMI 是從小孢子靈芝(圖六)拿到的一段免疫調節蛋白基因,它的基因序列和 LZ-8 類似,但又不完全一様。當時為了避開 LZ-8 被日本學者專利的基因部位,我將手上眾多的靈芝菌種以 genome walking 的方法進行基因選殖,發現有某些物種的基因序列和 LZ-8 不一様,而 GMI 就是其中之一。

把它送到嗜甲醇酵母菌進行表達,結果發現,表達出來的蛋白,不論分子量或基因序列,都和原本的 GMI 完全一様。隨後再把這個蛋白純化做成結晶,可以看出它是由四個單體組合而成(圖七),和 LZ-8、金針菇免疫調節蛋白(FIP-fve)的立體構造非常相似,但仍有些微差異(圖八),而這些差異正是造成它們功能上有所不同的原因。(7

GMI-061989 年由〔圖六〕許瑞祥所命名的新種靈芝──小孢子靈芝(G. microsporum)。(提供/許瑞祥)

 

GMI-07

〔圖七〕來自小孢子靈芝的 GMI 蛋白是由四個單體組合而成。(提供/許瑞祥)

 

GMI-08

〔圖八〕GMI、LZ-8、金針菇的免疫調節蛋白(FIP-fve)的結晶有「大同小異」的立體結構,

這些些微差異,正是造成它們在功能上有不同表現的關鍵因素。(提供/許瑞祥)

 

為了驗證這個成分能否被產業化,我們開始建構生產技術來生產這個蛋白。以酵母菌 Pichia pastoris 液態發酵生產 GMI 為例,已經完成 5,000 公升發酵槽的生產配方與產程調控技術,每公升培養液可回收、純化重組蛋白達 0.5 公克以上。

目前這個蛋白在發酵槽生產後,經過回收、濃縮、純化,可以做出 95% 以上純度和 75% 以上純度的蛋白。未來如果當作蛋白藥物使用,可以用前者來做;當作食品用後者來做即可。

 

GMI 有多種功能性,口服就有效

當你可以大量表現這個蛋白時,就能給很多科研單位做功能性實驗。目前為止,GMI 在細胞與動物實驗被證實,在相對低劑量下(5 ug/ml)具有刺激人類 T 細胞株分泌 IL-2、降低發炎因子分泌、抑制 NF-κB 轉錄活性、抑制腫瘤生長和轉移,以及誘發腫瘤細胞凋亡等能力,顯示其可用於調節免疫、調節血糖、抗癌與輔助抗癌等蛋白質藥物的開發。動物實驗也證實,GMI 可以促進離乳小豬的存活率達到 100%。此外,GMI 還可促進神經細胞再生。

● 美國 NIH 證實 GMI 對多種癌細胞有效

這個蛋白要產業化,必須經過第三方公正單位的評估,因此我們委託美國 NIH(National Institutes of Health,國立衛生研究院,是美國聯邦政府中首要的生物醫學研究部門)以 9 種不同的癌,共計 60 個癌細胞株,對 GMI 進行實驗。

實驗結果詳見下圖,往上的長條圖代表它有殺死癌細胞的能力,往下的長條圖代表它有抑制癌細胞生長的能力,這說明了 GMI 對於美國人常見的癌症,包括:血癌、非小細胞肺癌、大腸癌、中樞神經癌、黑色素瘤、卵巢癌、腎臟癌、前列腺(攝護腺)癌,以及乳癌,都有不同程度的抑制或殺癌細胞的能力(圖九)。

GMI-09

〔圖九〕美國 NIH 證實 GMI 對美國人常見的 9 種癌症有抑制作用。

(提供/許瑞祥。點選圖片可放大)

 

● GMI 的有效劑量很低

我們也與不同的學術單位合作,對GMI抑制非小細胞肺癌、乳癌、口腔癌等細胞株的作用進行實驗。值得注意的是,它的劑量單位是 micromolar(μM),換算成重量就是microgram(μg),千分之 mg,代表它很容易達到有效劑量。

動物實驗即證實,以口服方式餵食非小細胞肺癌的動物 GMI,每公斤體重餵食 18~16 mg 就能產生抗腫瘤作用,這個濃度比起靈芝其他有效成分相對低很多。

● GMI 抑制非小細胞肺癌

2011 年我在北京舉辦的〈國際靈芝研究學術會議〉報告時,曾放了這張投影片(圖十),這是當時 GMI 最新的報告(8,餵食接種非小細胞肺癌的小鼠,比較有用和沒有用 GMI 的腫瘤大小,證實口服 GMI 確實是有效的。至於這個蛋白質為什麼口服有效,目前還不清楚。

GMI-10

〔圖十〕靈芝GMI對小鼠的非小細胞肺癌腫瘤,有顯著的抑制作用。

(資料來源/Autophagy, 2011; 7(8): 873-882.)

 

● GMI 抑制口腔癌幹細胞

GMI 不只對一般的細胞株有效,對癌幹細胞(cancer stem cell)也有效。癌幹細胞是癌細胞分化前的母細胞,治療癌症時,如果癌幹細胞沒被清除掉,很容易使得原本好轉的病情再度惡化而出現擴散和轉移,因此醫學界希望能用標靶的方式找到癌幹細胞,進而抑制它或殺掉它。

而根據我們的細胞實驗,不同濃度的GMI可以對這些帶有特殊分子標記的癌幹細胞產生抑制作用;動物實驗也證實,每天給小鼠吃 150 µg 的 GMI,可明顯抑制口腔癌幹細胞的生長,此結果再次說明這是一個口服有效的蛋白。

● GMI 有抗氧化作用

另外我們也發現,這個在細胞外沒有抗氧化能力的蛋白,在細胞內可增強維生素C的抗氧化能力。

● GMI 促進神經細胞再生

至於 GMI 對神經細胞再生的作用,我們做了兩個實驗,一個是前處理(先給 GMI再傷害神經細胞),另一個則是同時處理(給 GMI 和傷害神經細胞同時進行)。結果發現,年輕的神經細胞,不管是前處理或同時,都會看到 GMI 有明顯的促進再生作用;對老的神經細胞,同時處理是沒效的,必須前處理才有效。這表示經常吃這個蛋白,神經受損比較容易恢復。

● GMI 對腦中風的保護作用

這是一個大鼠的中風模式,把 GMI 從靜脈注射進去之後,在 3.3 µg/kg 的劑量下,從腦部切片可發現,有注射 GMI 者,比沒注射 GMI 者,所受到的腦部氧化傷害要少很多。

 

GMI有食品等級的安全性

以上介紹的是 GMI 的藥用用途,接下要和大家報告 GMI 作為食品添加物和保健食品的用途,相信 GMI 在這方面的應用可以讓它的開發更寬廣。作為一個食品的首要條件是它的安全性,我要再次強調,一個成分一定要先求安全、再求確效,最後才是量產。

根據GMI的安全性報告,在急毒性與亞慢毒性的動物毒理實驗條件下,以 150 mg/kg 劑量的 GMI 連續 14 天,以及 100 mg/kg 劑量的 GMI 連續 90 天餵食大鼠,並未發現任何不良反應,顯示它具有食品等級的安全性。

在如此高度安全和功能的條件下和,GMI 已取得美國食品藥品管理局(US FDA)新饍食成份上市前通知(New Dietary Ingredient Notification),預計從2016年開始就會有 GMI 產品在美國販售,而產品的保健訴求將涵括抗發炎、抗氧化、免疫調節、調節血糖等功效。

 

GMI可以提高動物的抵抗力、存活率、飼料換肉率

除了藥品、保健食品,動物保健食品市場也是我們關注的另一個焦點。把 GMI 用在寵物身上,可以對 O-157 出血性大腸桿菌引起的急性腸道發炎,發揮抑制發炎、保護腸黏膜的作用,此結果讓我們相信它可以被開發成飼料添加物。

動物實驗也證實,把這個蛋白以 20 µg/kg 的劑量添加到飼料裡,可以增加飼料換肉率,提高保育豬的存活率,減少抗生素的使用,提高疫苗的效價。以下這張圖,左邊是吃了 40 天 GMI 的母豬,右邊是和母豬同個時候出生的公豬,但沒有吃 GMI。自然界的動物通常是公的體積比母的大,但原本同様大小的小豬,40 天後母豬竟長得比公豬大(圖十一),明顯可以看出有無餵食 GMI 的差別。

GMI-11

〔圖十一〕有吃 GMI 的母豬(圖左)長得比同齡的公豬(圖右,未吃 GMI)大,

顯示 GMI 能提高飼料換肉率。(提供/許瑞祥)

 

GMI可以量產,極具市場競爭力

總結來說,這個蛋白目前因為可以量產,而且功效明確、安全性高,將來在食品、藥品、美容保養品、動物飼料等的應用上,都可直接產業化和商品化。我們研究靈芝這麼久,當然希望靈芝的成分可以改善人類和動物的健康。多醣和三萜要萃取,可能它的價格會是一個門檻,而這個蛋白可以大量被表現,因此它的價格應該會極具市場競爭力。

 

延伸閱讀

1. 靈芝在生技領域研發的新趨勢

2. 真菌種源鑑定先驅,台灣大學生化科技學系許瑞祥教授穩固菇蕈產業根基

 

參考文獻

1. 許瑞祥,1990,靈芝屬菌株鑑定系統之研究,國立臺灣大學農業化學所博士論文。

2.  Moncalvo JM, et al. 1995. Rhylogenetic relationships in Ganoderma inferred from the internal transcribed spacers and 25S ribosomal DNA sequences. Mycologia, 87: 223-238.

3. 王惠芳,1996,靈芝屬含錳超氧歧化酶基因之研究,國立臺灣大學農業化學研究所碩士論文。

4. Cao Y, Wu SH, Dai YC. 2012. Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom “Lingzhi”. Fungal Diversity, 56:49-62

5. 戴玉成等,2013,中國靈芝學名之管見,菌物學報,138(06) : 947-952.

6. Bastiaan-Net S,et al. 2013. Biochemical and functional characterization of recombinant fungal immunomodulatory proteins (rFIPs). Int Immunopharmacol. 15:167-175.  

7. Wu MY, et al. 2007. A 2.0 Å Structure of the Fungal Immunomodulatory Protein GMI from Ganoderma microsporum. 臺灣大學生化科技學系會議論文。

8. Hsin IL, et al. 2011. GMI, an immunomodulatory protein from Ganoderma microsporum, inducesautophagy in non-small cell lungcancer cells. Autophagy 7:8, 873-882.