〔蘇慶華專欄〕靈芝研究在北醫之5 ── 健康、好吃又有趣的靈芝珍珠圓

靈芝也可以做成一顆顆半透明的「珍珠圓」?作者回顧三十年前如何在經費拮据下就地取材,DIY出一套既節能又環保的「靈芝菌絲球生產器」,為時任北醫院長的董大成教授研究「靈芝多醣抗癌」提供穩定的實驗材料。董教授還把這些帶有菇菌香氣、一點點甜、口感像愛玉的靈芝珍珠分送實驗室十幾人天天吃,一個月下來大家的免疫力都變好了……

文/蘇慶華

◎本文原載於2015年《健康靈芝》第66期 2~5頁

 

1985年來到北醫後,當時的校長董大成教授研究靈芝已經兩、三年的時間了,卻一直苦無穩定且成分較為固定的材料。那時候大家對靈芝還沒有很清楚的認識,很多人提供的都是號稱「依循古法」煉製的靈芝,以現在的看法,大概只是含有一些多醣的樣品。即使如此,董教授把這些樣品用在研究免疫抗癌,也都會得到一些正面的結果,只不過每次實驗的結果都不穩定。

所以,我來到北醫的第一個任務就是培養靈芝。然而靈芝有不同生長階段的產品,就如我們所熟知的菌絲體和子實體,董教授和我討論後決定以菌絲體的培養作為開始,也較符合他以免疫抗癌為主的研究方針。至少,我的加入應該對材料的準備會有一些幫助。

 

無意間發現靈芝菌絲會形成漂亮的菌球

於是我開始準備瓶瓶罐罐,這些事情對我來說已經駕輕就熟,因為只要把過去培養植生蟲草的經驗移植過來就行了,而且靈芝的生長條件也十分類似。

在向菌種中心購得菌種後,開始繁殖放大培養,從試管到培養皿,再從培養皿到三角錐瓶,進入震盪搖床液態培養。由於靈芝是一種好氧的真菌,如果在三角錐瓶液態培養基中靜置培養,靈芝便會在液面形成一層菌絲,並逐漸成為類似海綿組織的菌絲餅。

只是這樣的培養方式對於多醣的產生比較沒有幫助,如果能讓三角錐瓶在震盪的情況下,整個液態培養系統都能提供均勻的氧氣,菌絲即可平均分佈在培養液中,一方面震盪培養的發酵效率較高,另一方面菌絲所產生的多醣也因為震盪而釋放到培養液中,可以讓後來的純化工作減少一道萃取的手續。

震盪培養有兩種方式,一種是往復式,另一種是迴轉式。往復式常會產生很大的噪音,也要用到特殊的坂口瓶(Sakakuchi flask);迴轉式雖然效率低一些,但較安靜,且可使用普遍可購得的三角錐瓶,這也是選擇震盪培養的一些考量。

由於實驗室才剛剛建立,所需要的設備東缺西缺的,好在國科會的研究計畫順利通過,讓震盪培養設備得以陸續到位而可開始進行測試。測試的項目包括迴轉速、培養基組成等條件,經過這些程序後發現,迴轉式震盪培養不同於過去植生蟲草會產生棉絮樣的菌絲體,靈芝會形成大大小小很漂亮的菌球。

當初也沒特別注意到這個特性,主要的任務是把樣品提供給董教授測試,董教授也覺得相當滿意。然而一個震盪培養器每次培養約兩星期大概只能生產1.5公升左右的培養液,純化出來的多醣對當時董教授的大量動物試驗是不足的,因此要再放大實驗室的產能,只有購入較大的震盪器,或用較大的發酵槽。

由於實在沒有空間來安置大的震盪設備,也沒有經費購買動輒百萬的發酵槽,所以只好就地取材想出一套可用、省錢又有效率的方法。

 

經費有限下自製大量發酵裝置

先前的專欄文章中即曾提到(詳見《健康靈芝》59期2~5頁),我的實驗空間本來是生藥實驗室,有點像中世紀的煉丹房,留下許多不同大小、各式各樣的玻璃瓶,這是我喜歡的東西之一,不像很多人會把它們清掉。我看中其中一個最大的20公升三口瓶,估計它至少可以裝16公升的培養液(不能裝到滿),這樣發酵一次就可以抵至少十次以上的震盪培養。

一開始我思考的是,如何滅菌和培養供氣。很剛好,這個三口瓶的大小可以放到滅菌釜中,也就是滅菌籃的直徑恰好放得下,如此一來滅菌就沒問題了。再者,如前所述,靈芝需要氧,因此要長時間通氣,於是我又買了一個養金魚的空氣幫浦作為供氧來源。

由於不能供給有雜菌的空氣,空氣都必須過濾,因此就用大的100 mL玻璃針筒塞上玻璃棉,其後再加一個飛碟型的細菌過濾器(0.2 μm孔洞),如此便可阻絕空氣中的污染源。

至於管路則用實驗室現成的玻璃管、矽膠橡皮塞,以及耐高溫的矽膠軟管來銜接。一般市售的塑膠空氣分佈器(sparger)因不耐滅菌的高溫而無法使用,因此空氣在培養瓶底部的出口,便以一小段矽膠軟管打數個洞來取代,作為分散空氣增加與液面的接觸面。

總之,一切考量都是以採用可高溫高壓滅菌的材質為原則,例如:玻璃、玻璃棉、矽膠軟管、矽膠橡皮塞等,這些都事先經過測試,證明養金魚的空氣幫浦經過過濾裝置後仍可推動此一系統;另外還安裝了取樣口、空氣出口、培養液補充口,以備不時之需(如下圖)。

由於最貴的三口瓶是現成的,買個養金魚的空氣幫浦約一、兩百元,連接通氣系統的玻璃管可以用本生燈燒成需要的角度,橡皮塞、矽膠管、注射筒等都可用實驗室現成的東西加以組裝,所以整個裝置完成後幾乎花不了多少錢。

一切準備就緒之後,先把注入培養液的三口瓶和管路分開滅菌,待冷卻後於無菌室接種,再加以組裝,即可進行發酵操演。這時,小小的菌絲接種點就會隨著揚升的氣泡上下滾動,逐漸長大形成一顆顆靈芝菌絲球。

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實驗室生產靈芝珍珠圓的裝置

1. 養觀賞魚的空氣幫浦;2. 粗空氣過濾;3.細空氣過濾

4. 冷卻水入口;5. 冷卻水出口;6. 取樣口;7. 進氣口

8. 出氣口;9. 培養液補充口;10. 空氣分佈器

(繪圖/蘇慶華)

 

靈芝菌絲發酵的培養基也可以DIY

如前所提,利用迴轉式震盪培養會形成菌絲球,但以這種空氣攪拌的方式,菌絲球會更為均勻,且有晶瑩剔透之美感。經過大約兩個星期,發酵就告完成。至於發酵的終點,一方面可觀察培養液中菌絲球生長的密度分佈在增加,另一種較科學的方式則是:

自取樣口採樣分析葡萄糖殘餘量,如果沒有葡萄糖剩下,就是生長終點了。取樣的方法很簡單,只要用燕尾夾夾住關閉出氣口,打開取樣口即可,因為在空氣幫浦通氣加壓之下,培養液會從取樣口自動流出來,每次取樣只需數毫升就足夠分析了。

通常我會加入比一般真菌培養基更多的葡萄糖,大約 4~5 %(一般約 1~1. 5 %),主要的目的是讓多醣的產率提升。也因為這樣,到了培養後期,經常可以看到培養液變得較為黏稠,顯示多醣已經釋放至培養液中。

培養液除了添加葡萄糖作為碳源之外,也需要氮源及礦物質。這些氮源和礦物質可以向試藥行購買現成的酵母萃取物(yeast extract)、麥芽萃取物(malt extract)或馬鈴薯葡萄糖培養基(potatoes dextrose broth),但最省錢的方式還是DIY――到市場買一些馬鈴薯,去皮、切丁,在沸騰的熱水中煮三十分鐘,趁馬鈴薯丁還沒煮爛之前過濾,取濾液加葡萄糖溶解後即可,大約200克馬鈴薯可做出1公升的培養液。

 

靈芝珍珠圓把免疫變好了!

所以整個過程都是用最節省的方式完成,培養過程也沒有污染,靈芝菌絲的生長也很有趣,董教授甚至帶很多學校的外國來賓前來參觀,彷彿這裡是一個觀光景點。其實這種培養方式就是所謂的「氣舉式發酵(air lifter fermentation)」,有別於機械攪拌式,雖然發酵效率稍微緩慢,但不會把菌絲球攪碎而易於分離菌絲和菌液。

由於培養液在發酵完成後會呈現帶有黏性的淡黃色透明膠狀液體,半透明的菌球很均勻地分佈其中,很像後來大為流行的珍珠粉圓,所以就稱之為「靈芝珍珠圓」吧!要將菌液與菌絲分開也很容易,只要過一下泡紅茶的不銹鋼濾網,靈芝菌絲球便會留在網內澄清的菌液即可經過超微過濾、冷凍乾燥,成為純白的多醣。

董教授除了拿我純化後的多醣餵養動物之外,後來還發現,尚未處理的靈芝珍珠圓放在冰箱存放一、兩天後,居然形成果凍狀,看起來很可口的樣子。於是董教授便請助理分裝在約 100 mL 的冰淇淋盒子中,請實驗室總共約十五位的老師、學生、研究助理每天吃一盒,連續三十天的時間。至於靈芝珍珠圓吃起來的味道,有點像愛玉,還帶點菇菌的香氣,雖然葡萄糖都已轉化成菌絲及多醣,但仍有一點點甜味。

每個人在吃靈芝珍珠圓的前、中、後要各抽一次血,用來檢查免疫細胞的變化。當時董教授剛租了一台第一代的流式細胞儀(flow cytometer),因此除了享用靈芝珍珠圓可以玩新的儀器之外,最重要的當然是免費了解自己的免疫狀況,那時在醫院分析一次可能要數千元之譜。

就在大家玩得很高興之際,董教授把數據和大家分享,結果顯示,吃了一段時間的靈芝珍珠圓之後,大部分免疫細胞的比率都顯著改善,其中尤以T4細胞最為明顯。

現在回想起來,我們早在二十幾年前就把所謂的「活靈芝」玩過一遍了。最近市面上也看到類似的產品,只是靈芝菌絲都打散呈棉絮狀,失去台灣美食珍珠粉圓的外觀,令人感到有點可惜。推測可能在培養菌絲時是用機械攪拌的方式,而不是用氣舉式發酵。

 

可惜了那些營養豐富的馬鈴薯煮液

去年(2014)八月,隨著生技界人士前往內蒙參訪,了解到內蒙是馬鈴薯的重要產地,也有很大的企業生產馬鈴薯澱粉。生產過程中,馬鈴薯必須先煮過後再將澱粉分離出來。煮過馬鈴薯的煮液富含氨基酸、微生素及礦物質,也就是我們作為馬鈴薯培養基的主角。

座談會中,我請教企業家如何利用這些煮液,他們馬上眼睛發亮,表情中又帶有些許愧意,原來這些很營養的煮液都被當成廢液處理,不僅沒有好好利用,還要繳水污費進行分解。

我於是提出靈芝珍珠圓的經驗,他們也深感興趣。只是對他們而言,要投資大型氣舉式發酵系統,還有大陸對靈芝「菌絲階段」產品的陌生,在對市場銷售不是很有把握的因素下,這個案子也就停留在規劃階段。(註:大陸稱菌絲為第一階段,子實體為第二階段,孢子粉為第三階段,最常見的靈芝產品原料是孢子粉。)

當然,掌握豐富的發酵資源是生物科技很重要的優勢,能夠利用幾乎不用錢的馬鈴薯煮液來生產有趣、健康又好吃的靈芝珍珠圓,一直是我最感興趣的課題。