〔蘇慶華專欄〕靈芝研究在北醫之3 ── 走進多醣的世界
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- 分類：臺北醫學大學 蘇慶華教授
- 建立於 2015-10-21, 週三 23:25
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多醣是靈芝，乃至其他食用藥用真菌的主要成分。就菇本身而言，為什麼要形成多醣？其化學結構有什麼特性？有哪些生理功能？臺北醫學大學教授蘇慶華不僅回顧了他在1995～2000年利用菌絲發酵生產靈芝多醣提供董大成院長做抗腫瘤實驗的有趣經歷，也回顧了他對於子實體中水可溶、鹼可溶與強鹼可溶多醣的探索。在這一步步挖掘的過程中，他最大的感想是，靈芝真是好東西，每一個萃取階段都有好的成分展現出來，而最好的多醣居然留在最後才出現……
文／蘇慶華
◎本文原載於2014年《健康靈芝》第63期 4～6頁
從1980年代開始，真菌代謝的多醣（polysaccharides）開始受到日本學者的關注，例如最早被拿來做實驗的香菇多醣（lentinan）、雲芝多醣（krestin），這兩種多醣的抗腫瘤研究逐漸為學界接受，並開發成為臨床用藥。
因此之故，許多安全上已被認可的食藥用真菌所代謝之多醣，也陸續被拿來做比較，一系列描述木耳多醣、白木耳多醣、裂摺菌多醣（schizophyllan）、竹蓀多醣……等等的論文相繼問世。靈芝身為藥用真菌之要角，自然無法置身事外，最早有關靈芝多醣的文獻即在此時出現了（Mizuno et al., 1985）。
建立多醣分子屬性的分析方法
多醣是真菌細胞壁主體的成分，也是構成真菌細胞壁的主要成員。多醣與幾丁質（chitin）互相交錯堆疊，形成一個具有彈性並賦予真菌細胞形狀的外殼，不僅能保護細胞，還具有通透性，使真菌細胞可以透過它來吸收水分及小分子養分，甚至能阻止具有破壞性的大分子（如分解性酵素， lytic enzymes）入侵。
雖然真菌細胞壁所構成的多醣有這些共通性，但不同種真菌所產生的多醣極其複雜，這也是研究上需要花許多力氣的原因。首先，多醣的合成過程不像蛋白質有一定的氨基酸序列及大小，同樣一組多醣合成酵素，受到養分供應及環境因素的影響，會多加或減少單醣接到多醣之長短；其次，這些酵素也會因為特異性不同而接上不同的單醣；連接時，架鍵的位置也會改變。
為此，科學家們設計了一套方法來描述多醣的分子屬性。第一個當然就是分子大小，常用的方法就是把多醣用固定大小的分子篩過濾或層析，再用已知大小的標準品做回歸求得。
有了已知大小的多醣後，取其中一部分用酸分解成單醣，檢測是哪一種或哪幾種單醣，其比率如何；然後取另一部分多醣，測定醣與醣之間是怎麼結合的，是1→2、1→3、1→4或1→6；最後再用酵素確定這些醣結合的方式是α-還是β-。
有了這些資料，我們就可以知道這個多醣的基本結構，例如β-（1→3）d-glucan即代表「具有由右旋（d）β葡萄糖、以1→3鍵構成之多醣」。
當初為了研究多醣，我花好幾年的時間才把儀器設備及特別的試藥程序建立起來。那時我剛到北醫，沒有玩過多醣，在大家都很熱中多醣的大環境下，嘗試自我學習。但不久之後，靈芝多醣已經被研究過了，在學術上失去了新穎性，所以當我開始研究多醣時，就鎖定了另一個物種――植生蟲草（Phytocordyceps ninchukispora）。
這是我在台灣發現的新屬，菌種只有我有，因此它所產生的多醣一定是新的，在新穎性上就沒有被挑戰的地方。跟我一起完成這項研究的，是我當時收的一位碩士班學生郭俊成（現任嘉南科大教授），他很努力將這些繁複的工作一一完成，建立標準的操作程序，非常感謝他的貢獻。
以發酵方式生產「量多質純」的靈芝多醣
除了分析方法之外，多醣的來源也很重要，如果能在多醣產生過程中控制量多而質純，後續的分離純化就會變得很簡單。以前在臺大農化所學到的發酵方法，很快解決了這些問題。
如前所述，多醣來自真菌細胞壁，可由子實體萃取純化，但一般子實體所含的代謝物較為複雜，多醣也夾雜後續形成的色素，因此最方便的方式還是來自菌絲體。由於真菌屬好氧生物，生長過程需要氧氣持續供應，而供氧量會決定液態培養菌絲體的生長速度，所以小樣品（500 mL以下）經常採用震盪培養，較大的樣品就要採用發酵槽通氣培養。
由於制式發酵槽很貴，我們只好自己設計，好用又便宜的克難式發酵槽於是應運而生。也由於這種低攪拌通氣方法，不管是植生蟲草還是靈芝菌絲，在此系統下產生的菌球就如同珍珠粉圓一般，非常美麗；加上長時間攪拌，細胞壁合成之多醣會釋放到發酵液中，最後形成天然活靈芝珍珠粉圓果凍，冷藏後也很可口（詳見《健康靈芝》59期第4頁）。
這些粉圓果凍先以離心分離菌絲體後，菌液只要經過一個分子篩的設備（這是一款名為Minitan、由Millipore公司製造的中小型超微過濾裝置）過濾兼清洗去除小分子，1公升的培養液一天內就可完成；接著再經過冷凍乾燥，每公升約4公克的純白色粗多醣就出現了。
有了這些原料，後續的研究即可順利進行，也可免除用酒精沉降法浪費許多酒精的困擾。可惜的是，Minitan裝置後來不再生產，以致接下來的研究得另覓他途。
靈芝菌絲體多醣的抗腫瘤研究
在完成原料控制生產及純化分析後，當然要了解這些多醣到底具有何種功能。檢視文獻後發現，多醣的生理活性主要在免疫功能之調節，然而免疫學一直是我的弱項，也缺乏研究信心，好在當時的董大成院長對靈芝多醣極有興趣，我也很樂意成為前段生產純化分析的生產供應者。
就這樣，由靈芝發酵產生菌絲體多醣的免疫抗腫瘤研究又活起來了。這段期間（1995～2000年），以董教授為主要作者在《癌症醫學會刊》發表了數篇論文，我受益良多，董教授也成為國內靈芝研究之先驅者。
同時間，我的學長賴敏男教授，對靈芝的液態發酵也深感興趣，有段時間幾乎天天來到我那個很克難又很有趣的實驗室，看靈芝珍珠粉圓的生長，和我一起分析殘糖含量、菌絲含量、多醣含量變化，並互相討論放大試驗的心得。數年後，賴教授開始建立自己在苗栗雙冬的大型發酵廠，成功的生產靈芝菌絲體，我也深感與有榮焉。
重新審視靈芝子實體
完成這階段的工作後，我的研究再度回到靈芝子實體。如前所述，靈芝子實體所含的水溶性多醣大概是乾物重的1%左右，相較菌絲體菌液中1公升只能取出4克（0.4%）純白的多醣，似乎有較高的產率。
然而在操作上，經過乾燥的子實體必須加入兩百倍左右的水進行萃取，亦即要取得4克的多醣，得用400克子實體再加80公升的水來萃取，不僅過濾的體積很龐大，所得到的粗多醣成分也相對複雜，常含有子實體的色素，使得多醣呈現咖啡色，這也是一開始我不太喜歡從靈芝子實體萃取多醣的原因。
1990年的某一天，我參加了一個靈芝研討會，一位從事靈芝栽培的朋友問我：「靈芝子實體無論用水或酒精萃取都會剩下許多殘渣（約90%乾物重）。這些殘渣除了當有機肥料，有沒有其它用途？」這個問題成了啟發我回頭研究靈芝子實體多醣的靈感。
雖然這段期間我把專注力放在靈芝子實體三類上，但也同樣發現，經過水或酒精萃取後的靈芝子實體，在外觀上幾乎沒什麼改變。於是問題又回到真菌細胞壁上，也讓我想起指導教授王西華的教誨：「真菌細胞壁就是幾丁質和多醣。」
於是我開始思考：「同樣都是細胞壁組成，為何不同蕈類有這麼大的差異？」像洋菇、鮑魚菇、金針菇及香菇都十分滑嫩可口，為何靈芝子實體久咬不爛且難以下嚥？這是否是因為幾丁質與多醣的比率不同造成的？因為幾丁質代表較為堅韌的組織（例如蝦蟹、昆蟲外殼），多醣則為黏滑吸水性較高的部分。
這些假設很快就得到答案。果然，靈芝子實體含有大量幾丁質（40～50%），而洋菇、鮑魚菇、金針菇等的幾丁質含量都小於1%，香菇則為3%。靈芝子實體既然含有這麼多幾丁質，為何不假以開發成為生醫材料？這於是成了我研究靈芝子實體殘渣的開端。
研究子實體殘渣的意外收穫 ── 鹼性可溶多醣
為了得到靈芝子實體幾丁質，首先須以熱鹼（1N NaOH，95℃）破壞蛋白質、核酸、脂質等不需要的雜質，於是就有了熱鹼萃取液。熱鹼萃取液本來也是不要的廢液，但我們把它回收，以超微過濾分子篩處理，不僅可取出鹼可溶多醣，回收率也超過水可溶多醣的六倍左右。
這很可能是靈芝子實體因為高溫鹼性造成化學鍵斷裂，而使更多的多醣從細胞壁上溶離出來。至於經鹼處理的殘渣，漂白後就成為白色紙漿狀的材質，我們將其命名為SACCHACHITIN，可以做成薄膜，也可以磨成懸浮微粒，是很好的傷口敷料。
基本上，SACCHACHITIN就是幾丁質和多醣的複合體。幾丁質經過去乙醯化（deacetylation）的過程可以得到幾丁聚醣（chitosan），而去乙醯化需要更強的鹼（如10 N NaOH）來處理，亦即鹼的濃度要比前一次處理強十倍。我們於是把SACCHACHITIN放到強鹼中，結果幾乎所有的SACCHACHITIN都溶解了。
照理講，幾丁聚醣是鹼性的，應該不會溶於強鹼中，因此我們推測，SACCHACHITIN除了幾丁質及多醣之外，可能還含有相當量的醣酸單體，以致在強鹼下可以溶解。
這些假說仍有待進一步證明，不過如果將這些溶解物再以超微過濾回收，更多的多醣就產生了――經過冷凍乾燥後，強鹼可溶的多醣高達24%。把靈芝子實體的水可溶多醣（1%）、鹼可溶多醣（6%）、強鹼可溶多醣（24%）三個處理步驟加起來能產出多達31%的多醣，遠超過液態菌絲培養的產值。
（提供／蘇慶華）
為了瞭解這三種多醣是否具有生理活性功能，我們也做了動物試驗。結果顯示，三種多醣都有抑制S-180肉瘤細胞在肺臟形成結瘤的作用，其中以強鹼可溶多醣最明顯，可抑制結瘤數目達65%，亦即結瘤數只有對照組的35%。另外再以流式細胞儀分析細胞週期的分佈狀況，也顯示服用強鹼可溶多醣的小鼠，正在分裂的肺部細胞（S-180肉瘤細胞）明顯下降。
這些結果告訴我們，靈芝實在是好東西，經過不斷挖掘，每一個萃取階段都有好的成分展現出來，而最好的多醣居然留在最後才出現，也完成了對靈芝子實體徹底應用的實例。到目前為止，好像沒有廠商對鹼性可溶的多醣進行開發，這可能牽涉其中重要的關鍵設備，需要一套有效率的超微過濾系統。
大型陶瓷超微過濾膜裝置技術在產業上之應用已經逐漸成熟，相信不久的將來，這些產品應可達到量產階段。