〔蘇慶華談靈芝廢渣/敷料〕靈芝子實體細胞壁抑制細菌的功能

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經過提取的靈芝子實體細胞壁,看起來就像紙漿一樣不起眼,但如果能思考它在大自然所扮演的角色,在某些情況下,它也可以發揮抑制細菌生長之特性。

文 ‧ 圖/蘇慶華

◎本文原載於2010年秋《健康靈芝》第50期 18~21頁

 

我們常常會問:「為什麼要服用靈芝?」第一個答案經常是:「服用靈芝可提升人體的免疫力。」可見靈芝在許多功效中,提升免疫力是被高度肯定的。免疫力提升,就是增強抗感染防線,可減低微生物感染之機率,也可在感染後迅速痊癒。

科學家已從眾多靈芝成分中一一釐清,並找到靈芝活性多醣(Polysaccharides)扮演此一功能之主要角色。不過,靈芝多醣除了吃進我們的肚子進而提升免疫力之外,它在自然界中到底又扮演何種角色?

實際上,靈芝多醣就是構成細胞壁的重要成員,它與另外一個叫做「幾丁質(Chitin)」的成分,共同組成大部分真菌的細胞壁。然而,真菌的種類何其繁多,至少也有十萬種,為什麼特別選擇靈芝來討論呢?因為靈芝有許多真菌所沒有的特性。

就細胞壁的厚度來說,靈芝子實體和我們常吃的香菇、洋菇、金針菇都不一樣,這些菇類多由薄壁組織(Parenchyma)所組成,因此可口味美;而靈芝子實體細胞壁特別厚,屬於厚壁組織(Sclerotium),所以靈芝子體幾乎是久咬不爛,且難以下嚥。這種革質化的構造,支撐整個子實體的形狀,也讓靈芝的孢子可以由子實體中散播出來。

此外,厚實的細胞壁也可以防止其它生物侵犯。靈芝子實體是由多醣和幾丁質所構成,這兩種成分的比率會影響組織的軟硬,一般來說,幾丁質含量越高,細胞的硬度就越高。根據我們的分析,靈芝子實體的幾丁質含量高達40~50%,而一般實用菌只有1~3%。這種與眾不同的細胞壁設計,很可能就是在防止其它微生物入侵,尤其是細菌。

 

靈芝細胞壁中的「多醣」和「幾丁質」有抑菌作用?

多醣和幾丁質這兩種成分,是如何組成靈芝細胞壁的呢?如【圖1】所示,幾丁質(多乙醯葡萄醣胺,Poly-N-acetylglucosamine)是一種直鏈構造,一條條幾丁質交錯成網狀結構,形成較堅實的網底(Network),然後再由多醣(β-1,3-glucan/β-1,6 side chain)一團一團地填充其間。多醣是一種比幾丁質更為親水之葡萄醣聚合物,性質較柔軟,也較容易斷裂或脫落;脫落下來的多醣如果小到水可溶的程度,就是一般我們服用的靈芝多醣。

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【圖1】直線代表幾丁質,曲線代表多醣;這兩種不同的成分

一層又一層地組織起來,形成靈芝堅靭厚實如皮革的細胞壁。

 

所以,靈芝細胞壁就是由這兩種軟硬不同成分,一層又一層地組織起來的。當然,細胞壁不能包得密不通風,至少水分和小分子的養分得通得過,細胞才活得下去。這時細胞壁就被賦予另一項功能,即「抵禦外侮」。在大自然中,各種生物會互相競爭以爭奪養分、求取生存。對靈芝而言,主要的競爭對手就是細菌,細菌繁殖迅速、為數眾多而且無所不在。

細菌和靈芝一樣沒有吞噬能力,也沒有像昆蟲的口器可以啃食細胞壁,只能吸收小分子養分。因此,細菌必須釋出各種不同的分解酵素(Lytic enzymes)到周遭環境中去分解大分子(如蛋白質、脂質、澱粉等),將它們分解之後,再吸收其中的氨基酸、脂肪酸、單醣到細胞內,供細菌生長和維持生命。

在細菌釋出的分解酵素中,蛋白水解酶(Proteinases)位居要角,因為這關係著細菌取得氮源之關鍵。靈芝或其它真菌要避免這類酵素的攻擊,必須構築防禦工事,而由多醣和幾丁質組成之細胞壁就符合此一需求。因此,我們建構一個假說:靈芝的細胞壁會與細菌的蛋白質分解酶結合,並使其失去活性,進而讓細菌的生長受到抑制【圖2】。

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【圖2】像鱷魚的圖代表分解性酵素,當它穿越細胞壁時,就會陷在其中而失去活性。

另一些脫落的多醣,經過萃取和濃縮後,就成了保健食品的成分。

 

研究證實,靈芝細胞壁能抑制細菌生長

為了證實此一假說,我們先取得純化的靈芝細胞壁。由於靈芝子實體在製成膠囊保健食品之過程中需要萃取濃縮,會留下許多殘渣,這些沒有明顯用途的組成實際上就是細胞壁。因此,原料取得全不費工夫,我們只要以熱(95℃)鹼(1N NaOH)去除蛋白,再以熱(85℃)過氧化氫去除色素,即成為純白紙漿狀的細胞壁。

由於細胞壁都是由分子超大的多醣和幾丁質所構成,這些紙漿狀物並不溶於水,因此我們進一步做了微米化的處理,使其成為平均粒徑為2μm之懸浮液(詳見《健康靈芝》49期p.6~9)。接下來我們也選擇一些細菌菌株,包括最常拿來做抑菌實驗的大腸桿菌(E. coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草菌(Bacillus subtilis)和金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

一開始我們想得很簡單,就是在細菌培養基(Nutrient agar)加入一定量的靈芝細胞壁懸浮液後,在37℃的條件下,於24小時後觀察細菌數,並與未添加細胞壁的組別比較,就能知道靈芝細胞壁的抑菌效果。沒想到一點效果也沒有,不論是有無添加靈芝細胞壁,兩組間根本沒有差異。稍加思考後才發現,細菌培養基中本來就有很豐富的氨基酸提供細菌生長,所以靈芝細胞壁的添加,即使能抑制蛋白水解酶的活性,也不會影響細菌生長,因為小分子的氨基酸已經在培養基中了。

所以培養基的設計有很大的關係,我們後來即改用以蛋白質為基礎的培養基,其中的蛋白質來源為明膠(Gelatin),結果就十分明顯:沒添加靈芝細胞壁懸浮液的組別,細菌生長正常;添加0.1%和0.5%細胞壁懸浮液的組別,則沒有細菌生長【圖3】。這顯示我們的假說可以成立,但仍須更直接的證據。

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【圖3】以明膠作為培養基的蛋白質來源,結果沒添加靈芝細胞壁懸浮液的組別,

細菌生長正常;添加0.1%和0.5%靈芝細胞壁懸浮液的組別,則完全沒有細菌生長。

 

蛋白水解酶的活性,會隨靈芝細胞壁懸浮液的增加而減少

於是我們進一步以類似的方法培養細菌(加入少量的Nutrient broth),並增加不同細胞壁懸浮液添加量的組別,由菌液分析蛋白質水解酶之活性。我們採用「呈色電永法(Zymography)」進行分析,也就是取菌液直接進行電泳,只要在膠片中加入少量明膠,於電泳結束後等待約30分鐘,再以蛋白質染劑讓蛋白質呈色:如果菌液中有蛋白質水解酶,在受到電泳分離後會因分子大小跑到一定的位置,同時也因為蛋白水解酶會分解明膠,因此在染色後會呈現無色的區塊,區塊的大小也呈現其活性之強弱【圖4】。

結果顯示,蛋白水解酶活性會隨著細胞壁懸浮液之增加而減少。此結果說明靈芝子實體的細胞壁本身並沒有殺死細菌的功能,但在被動防禦的過程中,我們可以利用它結合分解性酵素之作用,有條件的抑制細菌生長;亦即在細菌生長的環境中,如果沒有小分子的養分,靈芝細胞壁足以成功地抑制細菌生長。

舉個實際的例子:靈芝細胞壁已開發成為有效的皮膚創傷敷料,它的其中一項功能,就是具有天然的抑菌效果,不需要額外添加其它抗生素或抑菌劑,也因此沒有抗生素抗藥性的問題。

如果我們的假說正確,大家又會問:「皮膚創傷中是否有大量小分子的養分存在,而使靈芝細胞壁之抑菌功能喪失呢?」答案很簡單,人體血液中雖然含有氨基酸,但經過凝血反應後,氨基酸的釋出已很有限,即使有部分釋出,也只能維持細菌短期之生長。

如果在創傷發生後及時使用靈芝細胞壁敷料,細菌的蛋白水解酶將受到抑制,人體組織蛋白就不會受到分解,細菌在無法獲得充足養分的情況下,將無法繼續增殖,殘餘的細菌很可能就被血管中移出的免疫細胞所吞噬,傷口即會結束發炎期而進入肉芽組織增生期,從而完成傷口復原之過程。

上述「靈芝的抑菌作用有助傷口癒合」,也是我們在多次動物和人體創傷癒合實驗中獲得的結論。這些傷口的種類包括:慢性長期無法癒合的創傷、急性的挫傷和燙傷等,靈芝細胞壁敷料均有顯著之成效。

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【圖4】以「呈色電泳法」分析菌液中的蛋白水解酶活性,呈色愈明顯者表示活性愈強。

各種細菌都會分泌蛋白水解酶,因此我們選取四種不同的細菌進行實驗,

圖中的1、2、3、4代表靈芝細胞壁之添加量,分別為0、0.1、0.5、1.0 mg/ml。

結果顯示,靈芝細胞壁添加量越多,蛋白水解酶活性就越低,甚至完全被抑制。

 

靈芝細胞壁對青春痘也有抑制效果

靈芝細胞壁對於傷口有明確的好處,但對於正常人有什麼幫助呢?是否也對細菌疾病的感染具有預防或治療上的意義?當然,靈芝細胞壁是超大分子,不能溶於水,也無法像抗生素一樣,可以口服或注射到體內去殺死或抑制內部的感染。不過,我們想用相同的假說來證實,靈芝細胞壁也會抑制痤瘡丙酸菌 (Propionibacterium acnes) 生長。

痤瘡丙酸菌是造成痤瘡(青春痘、粉刺)的元凶,原本是皮膚的正常菌叢之一,具有兩種特質:其一,它喜歡在沒有氧氣的環境下生長;其二,它喜愛脂肪做為碳源,簡單講即「愛油勝於糖」。培養細菌一般都用葡萄糖作為熱量來源,而培養痤瘡丙酸菌,則要加入一些脂肪才會長得好。

青春期時,由於荷爾蒙分泌旺盛,常導致油脂累積於毛囊中,阻塞於毛孔,這種環境正是痤瘡丙酸菌的最愛。一方面由於毛孔阻塞造成氧氣缺乏,另一方面又提供大量的脂肪供其生長,於是痤瘡丙酸菌就在毛囊中大量繁殖,並產生丙酸引起發炎,甚至造成二次感染,形成疤痕,影響容貌。

如果我們把上述之假說稍做修正,亦即「靈芝細胞壁也會與痤瘡丙酸菌所產生之脂酶結合,並使其失去活性」,這樣就會阻斷痤瘡丙酸菌分解脂肪,使它無法取得能量而不能進一步繁殖。

為了證明此一想法,我們設計了一些實驗:首先是從菌種中心取得痤瘡丙酸菌的標準菌種,並以指定的培養基在厭氧環境下使其生長。此外,為了讓痤瘡丙酸菌生長的結果可以更明顯地顯示,我們還在培養基中加入一種叫「維多利亞藍(Victoria Blue)」的指示劑。

它是一種陽離子染劑,當痤瘡丙酸菌利用脂肪時,會將脂肪分解成甘油和脂肪酸,脂肪酸帶有負電荷,會與維多利亞藍結合成為無色沉澱物。因此,如果試管是無色,表示痤瘡丙酸菌生長旺盛;相反的,如果試管呈現藍色,即顯示痤瘡丙酸菌受到抑制。

實驗結果如【圖5】所示,加入靈芝細胞壁懸浮液的培養基,痤瘡丙酸菌之生長很明顯受到抑制。此外,我們也用純的脂酶作為研究對象,結果也十分類似。有了初步的證據後,最重要的就是去看,靈芝細胞壁對青春痘到底有無實際效果?答案如【圖6】。

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【圖5】靈芝細胞壁抑制痤瘡丙酸菌的實驗:

藍色顯示痤瘡丙酸菌沒有生長(B1、B2,添加0.5%靈芝細胞壁),

黃色(P2)和草綠色(P1)未添加靈芝細胞壁,

前者的痤瘡丙酸菌旺盛生長,後者則因接種菌數較少而呈少量生長。

 

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【圖6】一位年輕人以靈芝細胞壁為化妝品,

兩個星期後青春痘的困擾大幅改善(左圖為使用前,右圖為使用後)。

 

靈芝細胞壁不只能夠抑菌,還很安全

經過提取的靈芝細胞壁,看起來只是像紙漿一樣不起眼,但如果能思考它在大自然扮演的角色,在某些情況下,它也可以發揮抑制細菌生長之特性,改善整個皮膚的微生物相,對皮膚創傷之癒合和修復有很好的幫助。尤其靈芝細胞壁的結構簡單而穩定,並不具有任何毒性,生物相容性高且具生物分解性;也因為它是間接抑制細菌生長,所以沒有抗藥性累積的問題。您不覺得,睡前把它塗在皮膚上,對自己又多了一層保護嗎?

 

延伸閱讀

1. 〔蘇慶華談靈芝廢渣/敷料〕靈芝子實體另類用途──人工皮膚之開發

 2. 〔蘇慶華談靈芝廢渣/敷料〕靈芝的抗菌作用

3. 〔蘇慶華談靈芝廢渣/敷料〕靈芝子實體萃取後殘渣再利用,促進角膜上皮細胞再生