台灣:松杉靈芝乙醇萃取物阻止攝護腺癌惡化的機制

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2018年10月5日/中國醫藥大學/Molecules

文/汪家仰(臺灣大學生化科技學系碩士班一年級)、吳亭瑶

 

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不管是投予荷爾蒙藥物或是切除睪丸,都是臨床常用的雄激素阻斷療法。其原理主要在減少或阻斷雄激素與攝護腺癌(也稱前列腺癌)細胞上的雄激素受體結合,使攝護腺癌細胞因為缺乏雄激素刺激而不再不斷增生。但通常病情控制一段時間後,癌細胞會進化為2.0版,變得不需雄激素刺激也能生長,甚至變得更有侵略性,轉移性更強,使治療陷入困境。根據中國醫藥大學發表在《Molecules》的研究顯示,松杉靈芝乙醇萃取物對於這種難治的攝護腺癌有很好的抑制生長、轉移、侵襲和促使凋亡的作用。

癌症惡化會致使攝護腺癌的病人死亡,而攝護腺癌由「雄激素依賴型」惡化成難以治癒的「非雄激素依賴型」──亦即原本需要雄激素刺激才會生長的癌細胞,會惡化成不需雄激素刺激或極少量雄激素刺激即可持續生長──是目前臨床治療最大的挑戰之一。

雄激素受體(androgen receptor,簡稱AR)受到雄激素刺激而活化,對攝護腺癌細胞的生長、存活和惡化扮演重要的角色。因此雄激素阻斷療法,也就是透過荷爾蒙治療或切除睪丸抑制雄激素對雄激素受體的刺激,常是臨床上給予攝護腺癌病人的第一線治療。

然而大多數攝護腺癌病人在治療一段時間後,會進一步惡化成致命的「非雄激素依賴型」,因此開發防治非雄激素依賴型攝護腺癌的治療新方法是十分必要的。

目前研究表明,活化脂質的生合成和攝護腺癌的惡化有相關性,而SREBP-1(Sterol regulatory element-binding protein-1,固醇調控元素結合蛋白-1)是一種調控脂質合成的關鍵轉錄調控因子。此外,在攝護腺癌從「雄激素依賴型」轉變為「非雄激素依賴型」的過程中,雄激素受體也扮演重要的角色。

2018年10月中國醫藥大學發表在《molecules》期刊上的研究表明,松杉靈芝子實體乙醇萃取物(Ganoderma tsugae ethanol extract,簡稱GTEE)可以有效抑制攝護腺癌細胞中SREBP-1及其下游與脂質合成相關基因的表達。

通過抑制SREBP-1,松杉靈芝乙醇萃取物GTEE可以減少攝護腺癌細胞中脂質的合成,更重要的是,可以降低雄激素受體和攝護腺特異性抗原(PSA)在雄激素依賴型和非雄激素依賴型攝護腺癌中的表達。

通過阻斷SREBP-1/AR這條信號通路,GTEE不僅抑制了癌細胞的生長和轉移,也造成了攝護腺癌細胞的凋亡。此研究結果闡述了松杉靈芝乙醇萃取物GTEE防治攝護腺癌惡化的分子機制,為松杉靈芝乙醇萃取物在這方面的開發應用提供重要的基礎。

 

實驗結果1:抑制SREBP-1及雄激素受體的基因和蛋白表達

從qRT-PCR(圖1 A)和Western Blot(圖1 B)的檢測結果來看,松杉靈芝乙醇萃取物GTEE對於攝護腺癌細胞中SREBP-1及其下游相關基因FASN和AR(雄激素受體)的表達有顯著的抑制作用。

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圖1  松杉靈芝乙醇萃取物GTEE抑制攝護腺癌細胞中
SREBP-1及其下游相關基因和蛋白的表達

〔說明〕LNCaP為雄激素依賴型人類攝護腺癌細胞株,C4-2為CRPC型(亦即非雄激素依賴型)人類攝護腺癌細胞株。(圖1 A)為利用qRT-PCR技術進行檢測基因表達量獲得的結果,(圖1 B)為利用Western Blot方法檢測蛋白表現量獲得的結果。圖中的Vehicle和β-actin為對照組。*p < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001代表與對照組(Vehicle)比較有顯著差異性。

 

實驗結果2:抑制癌細胞中的脂質合成量

由圖1和圖2的結果來看,松杉靈芝乙醇萃取物GTEE可以通過抑制攝護腺癌細胞中SREBP-1和其下游相關基因FASN和AR的表達,使癌細胞內的脂肪酸含量和脂質累積減少。

由於癌細胞內的脂質含量與癌細胞的生長和惡化呈正相關,也有研究認為癌細胞中的脂質是癌細胞的能量來源,因此,松杉靈芝乙醇萃取物GTEE可使攝護腺癌細胞中的脂質減少,可視為攝護腺癌細胞受到抑制的表徵。

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圖2  松杉靈芝乙醇萃取物GTEE減少攝護腺癌細胞中
脂肪酸(A)和脂質(B)的累積

〔說明〕在攝護腺癌細胞中加入松杉靈芝乙醇萃取物GTEE(0.2或0.4 mg/mL)或0.3%乙醇(Vehicle組)一起培養24小時,脂肪酸(圖2 A)和脂質(圖2 B)在細胞中的相對含量占比。脂肪酸的含量測定使用fatty acid quantification kit,脂質累積測定使用Oil Red O染色。

*p < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001代表與對照組比較有顯著差異性。最下面一張圖中箭頭所指的是癌細胞內的脂質微滴,圖上右下角的黑色比例尺的長度=100μm。

 

實驗結果3:抑制癌細胞生長

由圖3結果來看,不同濃度的GTEE和不同的作用時間,都可對攝護腺癌細胞的生長產生抑制作用,其對雄激素依賴型人類攝護腺癌細胞株LNCaP的半數抑制濃度(IC50)為0.746mg/mL(處理48小時);其對非雄激素依賴型人類攝護腺癌細胞株C4-2的IC50則是0.735 mg/mL(處理48小時)。

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圖3  松杉靈芝乙醇萃取物GTEE抑制攝護腺癌細胞生長

〔說明〕在攝護腺癌細胞中加入不同濃度(0.2~1 mg/mL)松杉靈芝乙醇萃取物GTEE一起培養24小時、48小時、72小時後,以MTS assay方法測定癌細胞的生長情形(數據呈現的是:癌細胞數量為對照組Vehicle的幾倍)。*p < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001代表與對照組比較有顯著差異性。

 

實驗結果4:抑制癌細胞的移動力與侵襲力

綜合圖4 A和圖4 B的體外實驗結果表明,松杉靈芝乙醇萃取物GTEE對「雄激素依賴型」和「非雄激素依賴型」的攝護腺癌細胞,都有抑制轉移的作用。

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圖4  松杉靈芝乙醇萃取GTEE對攝護腺癌細胞
移動力和侵襲力的抑制作用

〔說明〕在攝護腺癌細胞中加入不同濃度松杉靈芝乙醇萃取物GTEE一起培養,以wound closure方法(圖4 A)和Boyden chamber方法(圖4 B)分析癌細胞的移動能力和侵襲能力。**p < 0.01,***p < 0.001代表與對照組(Vehicle)比較有顯著差異性。

 

實驗結果5:促使癌細胞凋亡

從圖5 A~C的實驗結果可知,松杉靈芝乙醇萃取物GETT對於「雄激素依賴型」和「非雄激素依賴型」攝護腺癌細胞都有促進凋亡的作用。

綜合這些實驗結果可知,不管是對於「雄激素依賴型」或「非雄激素依賴型」的攝護腺癌細胞,松杉靈芝乙醇萃取物GETT都能通過抑制SREBP-1,減少雄性激素受體,進而降低癌細胞的生長、轉移和侵襲能力,並促使癌細胞凋亡。這說明,松杉靈芝乙醇萃取物GTEE有潛力發展為防治攝護腺癌細胞惡化的藥物。

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圖5  松杉靈芝乙醇萃取GTEE經由活化凋亡蛋白的路徑
誘導攝護腺癌細胞凋亡

〔說明〕把攝護腺癌細胞和不同濃度松杉靈芝乙醇萃取物GTEE一起培養,經過24小時後,不管是雄激素依賴型的LNCaP或非雄激素依賴型的C4-2,癌細胞凋亡的比例會隨GTEE濃度的增加而增加(圖5 A),測得的凋亡蛋白(caspase 3和7)活性也和GTEE濃度呈正相關(圖5 B)。***p < 0.001代表與對照組(Vehicle)比較有顯著差異性。

此外,當攝護腺癌細胞和1.2 mg/mL的GETT培養20小時後,可以驗出大量被剪切過的凋亡蛋白(C-caspase 3),caspase 3在經過剪切後會被激活成為細胞凋亡的執行者,它的出現代表細胞只有凋亡一途,無法再走回頭路(圖5 C)。

圖5 D則總結了松杉靈芝乙醇萃取物GETT抑制攝護腺癌細胞(包括雄激素依賴型和非雄激素依賴型)的作用機制:通過抑制SREBP-1,減少雄性激素受體(AR),進而降低癌細胞的生長、轉移和侵襲能力,並促使癌細胞凋亡。

〔資料來源〕Huang SY, et al. Ganoderma tsugae Inhibits the SREBP-1/AR Axis Leading to Suppression of Cell Growth and Activation of Apoptosis in Prostate Cancer Cells. Molecules. 2018 Oct 5;23(10). pii: E2539. doi: 10.3390/molecules23102539.