〔柯俊良專欄〕靈芝免疫調節蛋白對肺腺癌的防治功效

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不同靈芝屬菌種皆含有一大約13 kDa分子量的蛋白質,具有免疫調節功能。根據本實驗室多年來的研究顯示,此類蛋白可以抑制肺癌細胞的端粒酶活性,促使肺癌細胞衰老和生長停滯。此外,靈芝免疫調節蛋白還能有效減緩上皮因子刺激癌細胞的轉移能力,並減少癌細胞本身的轉移和移行能力;與化療藥併用還能提高療效,提升白血球數量。

文.圖/柯俊良

◎本文原載於2010年4月《健康靈芝》第48期 4~7頁

 

近年來中草藥在抗癌方面的能力陸續被證實,其中靈芝一直被視為傳統中藥的翹楚,其有效成分包括靈芝多醣體、靈芝三萜類和靈芝免疫調節蛋白等等。

許多細胞和動物實驗已經證實,靈芝多醣體和靈芝三萜類具有抗腫瘤等功能,而不同靈芝屬菌種,如小孢子靈芝(Ganoderma microsporum )、赤芝(G. lucidium)和松杉靈芝(G. tusgae),皆含有一大約13 kDa分子量的蛋白質,它們都具有促進淋巴球增殖及刺激干擾素-γ表現量的功能,且其胺基酸序列與免疫球蛋白重鏈區高達30%相似度,不具有半胱胺酸(cysteine),因此不易被氧化和水解。

我的授業恩師中央研究院林榮耀院士所領導的研究團隊,統稱這類蛋白質為「靈芝免疫調節蛋白質」。

 

抑制肺癌細胞的端粒酶活性,提高治療效果

在許多癌症中可偵測到端粒酶活性,而體細胞中,除了幹細胞、淋巴球、角質細胞和造血原細胞之外,一般正常組織和細胞中通常偵測不到此酵素的活性。染色體端粒酶的再活化可使正常細胞具有高度的細胞增殖速率,進而走向不朽化,並提高正常細胞轉型成惡性腫瘤的機率。

更有研究進一步指出,非小細胞肺腺癌病人的端粒酶活性,與高度的細胞增殖速率和惡化程度有關,因而推測端粒酶活性是肺癌患者重要的預後因子之一,特別是端粒酶活性低者,其預後表現較佳。所以端粒酶的活性控制,可能是發展新型癌症治療策略的主要標的之一。

目前科學界對端粒酶的調控已非常清楚,特別是「端粒酶反轉錄酶(telomerase reverse transcriptase subunit,簡稱hTERT)」的基因表現量(mRNA),其在腫瘤組織表現很高,但在正常組織表現卻特別低;如果將hTERT基因轉殖到不會表現端粒酶活性的細胞株,則可使該細胞株表現出端粒酶活性。由此可以進一步推測,hTERT的轉錄活化可能是調控端粒酶的主要步驟。

一般常以「染色體端粒酶重覆增幅步驟(telomeric repeat amplification protocol, TRAP assay)」來偵測端粒酶的活性,結果發現,隨著靈芝免疫調節蛋白濃度增加,A549肺癌細胞株端粒酶的活性明顯降低。

再以半定量(RT-PCR)和定量(real-time PCR)分析,結果發現,hTERT的mRNA也會隨著靈芝免疫調節蛋白濃度增加而減少。進一步以啟動子螢光報告基因活性分析,結果發現,隨著靈芝免疫調節蛋白濃度增加,hTERT啟動子活性亦隨之減少。

我們的結論顯示,靈芝免疫調節蛋白處理細胞後,在基因層次上,靈芝免疫調節蛋白藉由抑制轉錄因子(c-Myc)與hTERT 啟動子的結合(圖1),降低hTERT 轉錄活性,最後導致端粒酶的活性喪失;在轉譯後修飾方面,靈芝免疫調節蛋白進到細胞的內質網,並且誘發內質網壓力造成鈣離子的釋出。

鈣離子的釋出會抑制AKt激酶的活性,使NF-κB無法與hTERT蛋白結合進入細胞核,進而抑制端粒酶的活性。同時使用蛋白輸出抑制劑(leptomycin B)和蛋白分解酶抑制劑(MG132),皆會阻止hTERT蛋白被帶出細胞核外,並且恢復端粒酶的活性,而根據我們的研究發現,靈芝免疫調節蛋白促使hTERT蛋白座落位置的轉移,也與核輸出機制有關(圖1)。

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圖1 靈芝免疫調節蛋白調控肺癌細胞端粒酶的訊息傳路徑

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此外,靈芝免疫調節蛋白也會造成肺癌細胞的細胞週期停滯在G1期,並趨於未成熟的細胞衰老。綜合上述研究發現,在肺癌細胞中,靈芝免疫調節蛋白在抑制端粒酶活性的過程裡,影響hTERT蛋白的座落位置(轉譯後修飾的調控),比抑制hTERT基因的表現(轉錄的調控)更顯重要。而經由動物實驗我們也證實,靈芝免疫調節蛋白確實具有抑制腫瘤生長的能力。

本實驗研究結果證實,自松杉靈芝菌絲體純化的免疫調節蛋白具有抗癌功效,此免疫調節蛋白可應用於抑制肺癌細胞的端粒酶活性,將來有機會發展出治療或搭配其他抗癌藥物一起處理,抵抗腫瘤,並減少腫瘤細胞的復發。

 

促使肺癌細胞衰老和生長停滯

我們的研究也證實,靈芝免疫調節蛋白會抑制A549、CaLu-1和H1355等肺癌細胞生長,但對人類正常細胞株則毫無影響。研究進一步發現,靈芝免疫調節蛋白可使肺癌細胞的細胞週期停滯在G1期,走向「未成熟的衰老反應(premature senescence)」,並明顯增加lysosome胞器增大, 此為衰老細胞重要特徵。

一般哺乳類細胞大多會藉由兩種細胞防禦機制,細胞凋亡(apoptosis)和細胞衰老(cellular senescence),避免正常細胞走向癌化階段。這兩種細胞防禦機制極具差異,細胞凋亡會造成細胞死亡;細胞衰老則會造成細胞走向不可逆的生長停滯。

細胞衰老還可分為「複製衰老(replicative senescence)」和「未成熟衰老(premature senescence)」,複製衰老主要是正常細胞因為染色體端粒複製問題所產生的生長屏障(Hayflick limit)進而誘發的細胞反應;未成熟的衰老則是細胞受到外在壓力(如氧化性傷害),造成年輕的細胞走向細胞老化的現象。

這兩種細胞衰老反應的差別主要在於,前者細胞的端粒序列長度會逐漸縮短,後者細胞的端粒序列長度則不受影響,但端粒序列的穩定受到破壞。兩者細胞型態和生理特徵皆相同,包括:細胞外型呈現平坦及脹大、細胞質顆粒狀囊泡增多等。

衰老反應所造成的生長停滯通常是細胞週期停滯在G1期所造成,且伴隨著活化細胞週期的「負調控者」,包括p53、Rb和cyclin-dependent kinase inhibitor(如p21CIP1、p27Kip1和p16INK4a)。

有文獻指出,透過活化腫瘤抑制基因或抑制抑癌基因,會造成癌細胞走向未成熟的衰老反應,產生類似衰老的現象。也有文獻指出,造成癌細胞走向未成熟的衰老反應,主要是抑制端粒酶活性和誘發細胞週期負調控者的表現所造成。

最近的研究也陸續證實,癌細胞會受到物理性或化學性傷害,而出現未成熟的衰老反應。此外,以抗癌藥物doxorubicin(俗稱小紅莓)和aphidicolin處理,也會促使腫瘤細胞趨於未成熟的衰老反應。由此可見,誘發腫瘤細胞趨於細胞衰老階段,已被視為癌症治療的新策略。

根據上述的理論基礎,我們利用細胞衰老的方法SA-[β]-Gal染色和acridine orange染色加以分析,結果發現,經靈芝免疫調節蛋白處理的A549肺癌細胞,細胞呈現SA-[β]-Gal的呈色反應佔23 ± 6%,Acridine Orange的呈色反應則佔45 ± 0.2%。以同樣的方法分析CaLu-1肺癌細胞,結果發現,經靈芝免疫調節蛋白處理後,細胞呈現SA-[β]-Gal 的呈色反應佔50 ± 5.8%,Acridine Orange的呈色反應則佔76 ± 2.8%。

不過實驗也發現,經靈芝免疫調節蛋白處理的A549肺癌細胞,其端粒序列長度並未受到影響。有文獻指出,細胞衰老的誘發決定於端粒序列的穩定,而不是端粒序列的縮短。未成熟的細胞衰老是抑制癌細胞生長的抗癌機制之一,因此顯示靈芝免疫調節蛋白抑制端粒酶活性,會造成肺癌細胞走向未成熟的細胞衰老。

 

抑制肺癌細胞的移行和轉移能力

目前國人肺腺癌治療已有部分使用標靶治療,特別是不抽菸的女性肺腺癌患者,她們的上皮生長因子受器(epidermal growth factor receptor,簡稱EGFR)通常具有突變,所以非常適合使用標靶治療藥,如艾瑞莎(Iressa)。因為艾瑞莎主要攻擊的目標就是癌細胞的EGFR,它會作用在EGFR位於細胞內酪胺酸磷酸化的部分,使EGFR失去刺激癌細胞增生、轉移的功能。

一般癌症細胞會先有移行性,接下來才會進行轉移作用(metastasis)。由於靈芝免疫調節蛋白質刺激A549細胞後,會使細胞的型態產生變化,推估可能會因此改變細胞的移行性。我們先將肺癌細胞經不同濃度(0、2、4、8μg/ml)的靈芝免疫調節蛋白質處理後,再利用傷口癒合評估法(wound healing assay)於不同時間觀察細胞有無移動性。

結果發現,時間增加24小時後,不添加和低濃度(2μg/ml)靈芝免疫調節蛋白質處理的肺癌細胞,仍可看到細胞移出,把原本所劃的線遮住;但經高濃度(4 和 8μg/ml)靈芝免疫調節蛋白質處理的肺癌細胞,則幾乎不會移出,甚至有一點細胞死亡且浮起的現象。其他經靈芝免疫調節蛋白質處理的細胞,只有在低濃度會細胞移出,而移出細胞的量,則沒有超過未經靈芝免疫調節蛋白質處理的細胞數量。

筆者最近也發現,自小孢子靈芝中純化的靈芝免疫調節蛋白,可有效減緩上皮因子刺激癌細胞的轉移能力,並減少癌細胞本身的轉移和移行能力(圖2),甚至影響到癌細胞轉移時重組的細胞骨架之形成。

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圖2 靈芝蛋白GMI對EGF誘發肺腺癌細胞轉移的抑制作用

 

與化療藥併用可提高化療,增加白血球數量

此外,我們的研究也觀察到,靈芝免疫調節蛋白可增加順鉑(cisplatin)的敏感度。順鉑是目前治療肺腺癌的基底藥之一,但病患往往也會因順鉑的治療產生噁心、嘔吐或掉髮的副作用,甚至造成白血球過低以致無法進行化療。而靈芝免疫調節蛋白可提高順鉑毒殺肺腺癌細胞的能力(圖3),只要四分之一濃度的順鉑,即可有效殺死肺癌細胞。

另外,靈芝免疫調節蛋白也可增加淋巴球的數目,幫助患者繼續使用順鉑治療。曾有一名診斷分期為ⅢB的患者,經順鉑和紫杉醇共同治療三個療程,並口服靈芝免疫調節蛋白後,腫瘤縮小到可進行手術開刀。此幸運的患者已完成手術切除腫瘤的治療,目前仍持續追蹤預後,筆者衷心期盼他能夠長命百歲。

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圖3 靈芝蛋白GMI與順鉑併用對肺腺癌細胞的抑制作用